[Doka 1]

genseq

спасибо за комментарии, так потихоньку клубок начинает разматываться,

сама ячейка стоит $99 (то, что на сайте называется Flow Cell), чтобы проводить эксперменты по секвенированию нужен еще MinION (~$1k) + адаптер FLONGLE (~$2k).

 

1. Вы хотите сделать собственные версии MinION и адаптера FLONGLE ?

2. какой сакральный смысл в разделении на "оцифровщик" и адаптер?.. почему адаптер FLONGLE не совместили с MinION? Какую функцию он выполняет???

3. на сайте указано, что во Flow Cell 126 ячеек, но о описании MinION сказано, что он умеет работать с 512 каналами - это про одну и ту же метрику?.. Правильно ли понимаю, что гипотетически в MinION можно поставить Flow Cell с 512 ячеёками и MinION все их "оцифровизирует"?

4. В моделях покруче, например для PromethION указано, что он может работать с 48 Flow Cell, поддерживая до 3000 каналов для каждой - верно ли предположение, что для PromethION используются иные Flow Cell, с иным количеством ячеек??

5. Какую важную потребительскую характеристику затрагивает число ячеек в Flow Cell? Как-то можно перевести или пропорционально соотнести число ячеек с необходиммым количеством экспериментов/ценой одного эксперимента/etc... ?

 

 

PS: извините за возможно наивные вопросы - я электронщик со школьной тройкой по биологии

[Flood 12]

23 часа назад, genseq сказал:

Оригинальные ячейки постараюсь добыть к концу года. За "дать погонять" буду весьма благодарен. MinION мне уже дали погонять, но у него ПО полностью закрытое и каждый пробный прогон требует полного перезапуска компа. Поэтому отрабатывать регенерацию его ячеек весьма затруднительно. А взломать некому.

Прочел Вашу статью на хабре и здешние сообщения. Если я все правильно понял, задача номер 1 - отработка технологии промывки пластиковых пакетов, чтобы не липли и не пахли после многократного использования. Для этого нужен прибор-тестер качества отмывки. В гораздо более далекой перспективе - разработка собственного секвенатора.

Мне кажется, что за промывку Вы взялись с намного более сложного конца, чем нужно. В природе уже существует полностью совместимый с ячейкой пикоамперный усилитель - адаптер Flongle. Имеется и АЦП с USB-интерфейсом (минИОН). Да, они относительно дорогие, но купить их будет намного проще и дешевле, чем сделать собственную работоспособную аппаратуру. Очевидно, что для начала работ по технологии промывки не требуется большое количество этих тестеров, работать можно будет на родном оборудовании, но со своим софтом.

 

Далее, для тестера промывки на самом низком уровне требуется решить задачу ровно одну задачу - получение корректных сырых данных с ячейки. Остальное сделает софт, сложность которого в этой теме пока рассматриваем (допускаю, раз Вы вообще беретесь за эту задачу, то программная сторона дела Вам по силам).

 

В результате нужно: или научиться получать сырые данные с минИОНа (1), или правильно подключить Флонгл к собственному многоканальному АЦП (2).

 

Самый правильный путь - это (1), т.к. он позволяет работать на заведомо исправной и пригодной аппаратуре. Сложность пути - возможно, в родном железе есть защита, а также может иметь место недокументированный и/или сложный этап подготовки аппаратуры к работе (например, какая-то специфическая калибровка под каждый запуск, без которой считываемые показания будут непригодны к использованию).

Путь к задаче (1) практически полностью софтовый, не требует никакой разработки железа, нужны только начальные затраты на приобретение оригинального оборудования. После решения задачи (1) логично и просто будет перейти к задаче (2).

Задача (2) также может решаться и без прохождения задачи (1), но это окажется сложнее, и, главное, результат окажется намного хуже верифицируем.

 

Вы же сразу хотите решить задачу (3), т.е. разработать свое железо, не поняв перед этим в деталях, как работает родное. Это может оказаться слишком сложно. Аналогично, решение сверхзадачи о собственном секвенаторе логично начинать, имея решение задач (1) или (2). Это позволит сразу погрузиться в гораздо более сложную, чем для тестера промывки, программную задачу. И уже по успехам на поле ее решения, думать о собственной аппаратуре. 

[genseq 0]

1 час назад, Doka сказал:

genseq

спасибо за комментарии, так потихоньку клубок начинает разматываться,

сама ячейка стоит $99 (то, что на сайте называется Flow Cell), чтобы проводить эксперменты по секвенированию нужен еще MinION (~$1k) + адаптер FLONGLE (~$2k).

 

1. Вы хотите сделать собственные версии MinION и адаптера FLONGLE ?

2. какой сакральный смысл в разделении на "оцифровщик" и адаптер?.. почему адаптер FLONGLE не совместили с MinION? Какую функцию он выполняет???

3. на сайте указано, что во Flow Cell 126 ячеек, но о описании MinION сказано, что он умеет работать с 512 каналами - это про одну и ту же метрику?.. Правильно ли понимаю, что гипотетически в MinION можно поставить Flow Cell с 512 ячеёками и MinION все их "оцифровизирует"?

4. В моделях покруче, например для PromethION указано, что он может работать с 48 Flow Cell, поддерживая до 3000 каналов для каждой - верно ли предположение, что для PromethION используются иные Flow Cell, с иным количеством ячеек??

5. Какую важную потребительскую характеристику затрагивает число ячеек в Flow Cell? Как-то можно перевести или пропорционально соотнести число ячеек с необходиммым количеством экспериментов/ценой одного эксперимента/etc... ?

 

 

PS: извините за возможно наивные вопросы - я электронщик со школьной тройкой по биологии

1. Я хочу найти специалистов, способных сделать отечественные аналоги  MinION и FLONGLE. Или хотя бы составить грамотное ТЗ на разработки таких аналогов. Кажется, здесь они иногда встречаются.

 

2. У MinION сенсорные лунки находятся на поверхности чипа, обрабатывающего сигналы. Поэтому его одноразовые ячейки (и встроенные в них чипы) стоят дороговато ($900), хотя имеют неплохую производительность (20...30 Gb). Адапторная вставка FLONGLE соответствует формату ячейки MinION, но содержащийся в ней чип можно использовать многократно, поскольку он в "мокрых делах" не участвует. Просто прижимается контактами LGA  (10х13) к уменьшенным ячейкам, не содержащим электронных компонентов. Производительность секвенирования на таких ячейках на порядок меньше (2...3 Gb), но и ячейки стоят на порядок дешевле ($99).

 

3. В ячейке FLONGLE 126 электродных лунок (4 контакта заведены на общий референсный электрод). На верхней стороне корпуса чипа MinION 2024 лунки с электродами. А в самом чипе имеется 512 каналов усиления, но перед этими усилителями стоят четырёхканальные мультиплексоры. И перед запуском прибора идёт оценка лунок и их деление на 4 категории. Секвенирование запускается на 512 самых лучших лунках, и после их выхода из строя переключается на лунки второй, а потом и третьей категории качества. Гипотетически можно вывести 2024 контакта со дна лунок чипа на его поверхность, прижать к этим контактам бесчиповую ячейку с таким же количеством лунок, и MinION сможет оцифровывать их сигналы так же, как и с обычных ячеек (пропускать через четырёхканальный мультиплексор и через 512 усиливающих каналов). Но технически это пока нереально. 

 

4. В ячейках PromethION находятся чипы с 9000 лунками. Сигналы с их электродов передаются на 3000 каналов усиления через трёхканальные мультиплексоры.

 

5. Главный параметр - производительность. Для полногеномного секвенирования её не хватает даже у ячеек PromethION. Но для многих клинических целей и производительность FLONGLE может быть избыточной.

Изменено 28 октября, 2019 пользователем genseq
опечатка

[Leka 0]

Для старта можно попробовать прикинуть оптимальную (по шумам) схемотехнику одного канала при таких параметрах:

емкость ячейки 50пФ,

номинальное напряжение на ячейке 100мВ,

максимальный ток ячейки 100пА,

требуемая полоса пропкскания 1кГц,

частота выборки 10кГц.

Вроде как данных достаточно.

 

 

Изменено 28 октября, 2019 пользователем Leka

[genseq 0]

8 часов назад, Leka сказал:

Для старта можно попробовать прикинуть оптимальную (по шумам) схемотехнику одного канала при таких параметрах:

емкость ячейки 50пФ, номинальное напряжение на ячейке 100мВ, максимальный ток ячейки 100пА, требуемая полоса пропкскания 1кГц, частота выборки 10кГц.

Вроде как данных достаточно.

Спасибо. Похоже, с исходными данными для расчётов картинка проясняется. Если ориентироваться на ячейки с одним каналом, то проблем нет.  Проблема в том, что ячейка должна быть мультиканальной (содержать 126 входных электродов), а выход - одноканальным (или двух-, четырёх-, восьми- или 16-канальным). И это сразу всё усложняет.

11 часов назад, Flood сказал:

В результате нужно: или научиться получать сырые данные с минИОНа (1), или правильно подключить Флонгл к собственному многоканальному АЦП (2).

Самый правильный путь - это (1), т.к. он позволяет работать на заведомо исправной и пригодной аппаратуре. Сложность пути - возможно, в родном железе есть защита, а также может иметь место недокументированный и/или сложный этап подготовки аппаратуры к работе (например, какая-то специфическая калибровка под каждый запуск, без которой считываемые показания будут непригодны к использованию).

Путь к задаче (1) практически полностью софтовый, не требует никакой разработки железа, нужны только начальные затраты на приобретение оригинального оборудования. После решения задачи (1) логично и просто будет перейти к задаче (2). 

Задача (2) также может решаться и без прохождения задачи (1), но это окажется сложнее, и, главное, результат окажется намного хуже верифицируем

Полностью с Вами согласен. И обсуждаю здесь второй путь только потому, что первый оказался тупиковым. Софт привязан к Интернету и не позволяет экспериментировать. А программисты, пытавшиеся что-то сделать, только разводят руками.

[a123-flex 0]

В 26.10.2019 в 22:04, iiv сказал:

но нужно не забывать, что человек, кто это будет планировать, будет обходиться вам примерно пол-года по 100 бакс в час.

Судя по всему, вас ТС явно не наймет. А второго такого вундеркинда чтобы такой ценник выставлял, здесь не найдется. Так что мечтать не вредно, но в данном случае, бесполезно))

А вообще, любой не вундеркинд даже, а просто  ̶н̶е̶т̶у̶п̶о̶й̶ неглупый человек, имхо уже давно должен понять, что в электроникс приходят за бесплатным советом или копеечной разработкой. Денег здесь не зарабатывают, и уж тем более 100$ в час)

По задаче, 10 квыб * 126 = 2.5 МБ/c для современной цифровой техники ничего. 

Можно через USB и стандартные дрова вытащить - Cypress.  Главное аналоговый тракт собрать, и цифрой не нагадить в него.

В 26.10.2019 в 17:35, iliusmaster сказал:

Начать нужно с 1-8 предусилителей, чтобы посмотреть характеристики сигналов со "штопанной" ячейки.  

Ув. illiusmaster Вам уже сказал, имхо весьма разумное, и самое реальное и бюджетное направление движения.

Для того чтобы предельно все упростить я бы предложил собрать для начала 2 одноканальных версии устройства, и ими рассмотреть Ваши источники сигнала, поэкспериментировать - возможно после этого задача полностью изменится, и окажется что комбайн нужно строить по другому, или вообще не нужно.

Ведь если производитель лочит весь девайс в целом, он может попытаться залочить (испортить) и датчики, судя по всему он очень в этом заинтересован ?

Либо, альтернатива, датчики могут непредсказуемо деградировать - что имхо скорее всего.

Для эксперимента вполне может оказаться достаточно и 50$, если есть в природе готовая платка усилителя.

ТЕ на Вашем месте я бы например поискал на али и ebay макетки или evaluation платки усилителей с чипами, которые здесь уже озвучили.

Имея усиленный аналоговый сигнал и цифровой осциллограф, тракт оцифровки изобретать не надо - Вы получите сразу готовую картинку и запись.

Есть осциллографы у которых можно вытащить значение семплов сигнала, соответственно, выборку можно будет взять на анализ в Матлаб etc.

[iliusmaster 5]

"Судя по всему, вас ТС явно не наймет. А второго такого вундеркинда чтобы такой ценник выставлял, здесь не найдется.Судя по всему, вас ТС явно не наймет. А второго такого вундеркинда чтобы такой ценник выставлял, здесь не найдется."

Ошибся человек. Хотел написать 100 долларов в день, что для Московского княжества вполне реальность(120-140т.р.)

 

[Leka 0]

Главное - максимально смягчить требования к схеме считывания (выкинув все необоснованные) - исходя из данной конкретной задачи.

Задача - не "измеритель пикоамперных токов", как кажется на первый взгляд.  

[Flood 12]

Почитав про технологию чуть подробнее, нашел что производитель разрешает промывку ячеек (втч, вроде и самых дешевых) и предлагает для этого промывочный кит. Но жизнь ячейки сильно ограничена, "until the buffer and nanopores are exhausted". Более того, ячейка требует холодное хранение и даже в требуемых условиях живет весьма недолго.

Каким же образом ТС хочет переиспользовать "дохлые" ячейки? Не просто промывая их, а восстанавливая мембраны и нанопоры?

[HardEgor 66]

22 часа назад, genseq сказал:

3. В ячейке FLONGLE 126 электродных лунок (4 контакта заведены на общий референсный электрод). На верхней стороне корпуса чипа MinION 2024 лунки с электродами. А в самом чипе имеется 512 каналов усиления, но перед этими усилителями стоят четырёхканальные мультиплексоры. И перед запуском прибора идёт оценка лунок и их деление на 4 категории. Секвенирование запускается на 512 самых лучших лунках, и после их выхода из строя переключается на лунки второй, а потом и третьей категории качества. Гипотетически можно вывести 2024 контакта со дна лунок чипа на его поверхность, прижать к этим контактам бесчиповую ячейку с таким же количеством лунок, и MinION сможет оцифровывать их сигналы так же, как и с обычных ячеек (пропускать через четырёхканальный мультиплексор и через 512 усиливающих каналов). Но технически это пока нереально. 

А может быть там стоят мультиплексоры не на усиление сигнала, а на подачу напряжения смещения? Тогда несколько ячеек соединяем по входам, а выбираем коммутацией смещения.

[genseq 0]

1 час назад, Flood сказал:

Почитав про технологию чуть подробнее, нашел что производитель разрешает промывку ячеек (втч, вроде и самых дешевых) и предлагает для этого промывочный кит. Но жизнь ячейки сильно ограничена, "until the buffer and nanopores are exhausted". Более того, ячейка требует холодное хранение и даже в требуемых условиях живет весьма недолго.

Каким же образом ТС хочет переиспользовать "дохлые" ячейки? Не просто промывая их, а восстанавливая мембраны и нанопоры?

Промывочный кит не регенерирует ячейки, а смывает старую ДНК. И позволяет на одной ячейке прогонять несколько проб.

Задача в том, чтобы восстанавливать мембраны и нанопоры.

1 час назад, HardEgor сказал:

А может быть там стоят мультиплексоры не на усиление сигнала, а на подачу напряжения смещения? Тогда несколько ячеек соединяем по входам, а выбираем коммутацией смещения.

Не понял.

[Leka 0]

Имхо. Какие требования к схеме считывания можно смягчить.

1. Токи утечек. Заметные (сопоставимые с сигналами) утечки можно допустить, если они постоянны (медленно меняются), их можно отдельно измерить, учесть, и вычесть в постобработке. Большие утечки увеличат требования к динамическому диапазону выходного сигнала. Допустив утечки, не превышающие максимальный ток ячейки (100пА), увеличим выходной диапазон вдвое, это увеличит на 1 требуемую разрядность АЦП.

2. Входная емкость. Из похожих соображений, можно допустить максимальную емкость, равную емкости ячейки (50пФ).

3. Тип усилителя. Импеданс ячейки на частоте 1кГц - единицы МОм, из-за емкости. При таком относительно низкоомном источнике, у трансимпедансного усилителя нет особых преимуществ, и можно попробовать другие варианты усиления. При полосе 1кГц и импедансе источника 1МОм, получаем оценку шумов: единицы нВ/sqrt(Гц) * sqrt(1000Гц) / 1МОм = сотни фА. Также получаем, что  токовые шумы усилителя не должны превосходить единиц фА/sqrt(Гц). 

Итог по схеме считывания.

Ток утечки входа не более 100пА, емкость входа не более 50пФ (поэтому допускаются мультиплексоры по входу). 

Шумы усилителя не более единиц нВ/sqrt(Гц) и единиц фА/sqrt(Гц) одновременно (это сильно ограничивает выбор усилителя).

Разрешение, ограниченное шумами, 0.1пА. 

 

[iliusmaster 5]

1. http://the-epic-file.com/text/bookz/aoe_3/ch_08/aoe3_08_11.htm

2. 5МОм. Импеданс ячейки. Покажите, пожалуйста другие варианты усиления. На что будете нагружать источник? на 50МОм?

3. Есть мультиплексоры с субпикоамперными токами утечки. Но любое их использование в этой задаче требует эксперимента.

 

[Leka 0]

32 minutes ago, iliusmaster said:

Покажите, пожалуйста другие варианты усиления. На что будете нагружать источник? на 50МОм?

Источник нагружать на собственную емкость (ячейка + все паразитные емкости).

Например, каждые 100мксек замыкаем емкость на 100мВ, размыкаем, емкость начинает разряжаться током ячейки.

dU/dT=I/C=50пА/50пФ=1мкВ/мксек, за 50мксек разрядится на 50мкВ. При токе 1пА разрядится на 1мкВ. 

Напряжение на емкости усиливаем усилителем напряжения, Кус=10000, на выходе 500мВ при токе ячейки 50пА, 10мВ при 1пА.

Считываем дважды между замыканиями, чтобы убрать влияние инжекции заряда, разность пропорциональна току.

 

В многоканальном интегральном исполнении (если дело дойдет до этого), такой вариант усиления будет гораздо проще.

 

[iliusmaster 5]

 "Кус=10000, на выходе 500мВ при токе ячейки 50пА, 10мВ при 1пА." Напряжение на емкости усиливаем..... Получается что ваш усилитель должен иметь СТАБИЛЬНЫЙ входной ток гарантированно меньше 1пА, чтобы не перепутать изменение входного тока усилителя с током ячейки.

Мне так кажется или вы ни разу не пробовали делать усилитель с усилением 10000 для частоты 10КГц.  с входным током меньше 1пА в интегральном исполнении.