[iliusmaster 5]

Если уж заговорили про ИТЭБ, то а лаборатории моей жены есть вполне себе аппарат, способный хорошо разрешать пикоамперы. Ибо ч к нему делал тестовую коробочку на 1, 10, 50 пА

[MegaVolt 25]

Может для начала взять что типа Keithley 24xx и снять все нужные характеристики? Построить модели и пр... а уж потом думать как это сделать дёшево и самостоятельно?

Потому что делать два дела одновременно это по моему самоубийство. Одно дело нам понятно что должно быть на выходе и мы под это строим коробочку. А другое когда мы строим коробочку но не можем понять что глючит коробочка или ячейка.

 

[iiv 18]

7 hours ago, MegaVolt said:

Потому что делать два дела одновременно это по моему самоубийство. Одно дело нам понятно что должно быть на выходе и мы под это строим коробочку. А другое когда мы строим коробочку но не можем понять что глючит коробочка или ячейка.

я полностью согласен, что если есть возможность что-то померить - это очень нужно сделать до того, как впадать во все тяжкие и разрабатывать эту электронику.

 

То есть я не стращаю, но предвижу, что эти измерения конечно помогут понять в каком направлении двигаться, но самое интересное начнется, когда ТС воткнется в свои ячейки и начнет не просто измерять фемтосопротивления, а именно их обрабатывать и смотреть на сколько то, что он видит соответствует тому, что он ожидает. Сколько человеко-лет тут будет закопано - одному ТС будет известно.

[genseq 0]

8 часов назад, controller_m30 сказал:

Понятно, спасибо!

1. А почему нужно подавать именно 100 мВ? Если подавать например 10 В (в 100 раз больше), то и протекающий ток тоже будет в 100 раз больше: вместо 50 pА - 5 nA. Это уже проще и дешевле усилить. Или исследуемый материал как-то разрушается от большего чем 0.1 В напряжения?

 

2. Что заставляет цепочку ДНК "лезть" в нанопору? Разность давлений на сторонах пластинки? Или разность напряжения (те самые 0.1 В)? Или какая-то более сложная электро-био-физика?

 

3. Что означают колебания тока 0..200 pA при протягивании цепочки ДНК через нанопору? В участке ДНК, под действием электричества, происходит какая-то хим-реакция, приводящая к увеличению потребления тока? А эта реакция идёт какое-то ограниченное время, и участок становится непригодным для дальнейшего исследования? Если так, то каждый исследуемый участок должен показывать какой-то сложный график потребления тока в процессе реакции, и этот график нужно отслеживать многими считываниями АЦП (сотни или тысячи семплов на каждый участок, проходящий через нанопору) .

Или с участком ДНК ничего не происходит, а просто меряется его сопротивление? Тогда оно наверное имеет линейную характеристику, и достаточно 3-5 считываний сигнала на каждый участок.

 

4. Каждый участок ДНК, находящийся в нанопоре, сколько может иметь разновидностей: 10, 100, 1000? (Это чтобы понимать, какое разрешение АЦП требуется для различения содержимого цепочки ДНК).

Например, достаточно ли регистрировать ток 0 pA и 50 pA - т.е. типа логическая 0, и логическая 1. (ну ещё >50 для аварийной ситуации с несколькими цепочками в одной нанопоре).

Или каждое значение тока 0, 1, 2, 3...49, 50 pA является информативным?

 

1. Выше 100 mV возможен пробой мембраны. А ниже - уменьшается ток и, соответственно, чувствительность регистрации сигнала.

 

2. Цепочка ДНК отрицательно заряжена по всей длине, и в пору её затаскивает и протягивает приложенное напряжение. При отсутствии какого-либо торможения однонитевая ДНК проходит через пору со скоростью около миллиона нуклеотидов в секунду. Тормозить её проскок могут несколько ферментов, но самый лучший вариант - хеликаза, которая со скоростью 100...200 нуклеотидов в секунду расплетает двойную спираль, расходуя при этом АТФ. Сейчас скорость работы хеликазы довели до 450 нуклеотидов в секунду. И сажают её на начало ДНК с помощью специального Y-адаптора довольно сложной структуры - с холестериновым якорем, апуриновым-апиримидиновым участком и дополнительным праймером. Этот адаптор пришивают на концы ДНК на стадии пробоподготовки. Хеликазное расплетание двунитевой ДНК обычно начинается ещё до захвата однонитевого хвоста порой, но после захвата этот хвост быстро проскакивает через пору. Хеликаза через неё не проходит, и секвенирование начинается только после того, как она упрётся в пору. 

 

3. Пора имеет широкие входной и выходной вестибюли и сужение, определяющее величину тока. При отсутствии ДНК ток равен примерно 50 pA. При прохождении через пору однонитевой ДНК величина тока снижается, причём это снижение зависит от проходящих через узкое место нуклеотидов. Причём сужение не такое уж и короткое, и на величину тока влияют не одиночные нуклеотиды, и даже не их димеры или тримеры, а четвёрки нуклеотидов. Т.е. изменение тока может иметь 256 градаций. Разобраться в этой каше близких сигналов нормальному человеку невозможно, поэтому для их расшифровки используют различные варианты искусственного интеллекта. В основном - рекуррентные нейронные сети (RNN).

 

4. Разновидностей сигнала может быть и больше 256, но этого уже никто не знает. ИИ сам выбирает алгоритмы расшифровки. И для получения информативного сигнала ток в диапазоне от нескольких pA до 50 pA нужно регистрировать с точностью порядка 0,1 pA. Или фильтровать и усреднять максимально возможное количество считываний, и этим повышать точность сигналов, расшифровываемых ИИ.

 

Не уверен, что сформулировал ответы наилучшим образом, но общая картин, надеюсь, ясна. Поэтому на разработку секвенатора не очень-то надеюсь. Тем не менее, не теряю надежду на то, что удастся разработать гаджет для отработки регенерации ячеек.     

8 часов назад, iliusmaster сказал:

Если уж заговорили про ИТЭБ, то а лаборатории моей жены есть вполне себе аппарат, способный хорошо разрешать пикоамперы. Ибо ч к нему делал тестовую коробочку на 1, 10, 50 пА

Мир тесен. Может быть, подскажете номер кабинета, в котором стоит эта коробочка? Или это было так давно, что следы уже затерялись?

[MementoMori 4]

Почему-то вспомнился фильм "Судья Дредд". Там у судей были пистолеты, анализировавшие ДНК того, кто берет их в руки, за одну секунду. И если пистолет в рука чужака, то происходило что-то страшное.... не помню что.

 

[Leka 0]

Раньше такие интегральные многоканальные (сотни каналов) схемы считывания малых токов делали, см концепт, просто и дешево. Подойдет ли для пикоамперных токов, надо считать подпороговый режим входного транзистора. После аналогового компаратора, который м/б вне данной интегральной схемы, например внутри FPGA (LVDS вход), получаем аналого-цифровое преобразование ток-время. dU/dT=I/C=100pA/100fF=1V/ms. 

Изменено 27 октября, 2019 пользователем Leka

[iliusmaster 5]

У Мироновой Галины Дмитриевны есть два приборчика. Один их них  сделан представителем старой школы  и потому прилично работает. Второй делал Максим, вот тот никак толком не работает.:(((( в общем договариваетесь с Талановым, вроде бы он занимается сейчас БЛМ. Я делал коробочку, в которой был комплект прецизионных сопротивлений на фторопластовой плате для поверки сего устройства.

Если уж очень приспичит и вы найдете оригинальную ячейку, то могу дать погонять электрометр от прецизионной системы дозиметрии. У него входной ток 6 фА. и разрешение в 10фА. на первом диапазоне до 50пА.

2. Что все уперлись в ИИ. Для решения такой задачи, то есть нахождения и идентификации определенного объекта в условиях неоднородной информации отработаны отличные статистические методы в радиолокации. Не надо везде совать ИИ. Это не панацея.

[genseq 0]

29 минут назад, iliusmaster сказал:

У Мироновой Галины Дмитриевны есть два приборчика. Один их них  сделан представителем старой школы  и потому прилично работает. Второй делал Максим, вот тот никак толком не работает.:(((( в общем договариваетесь с Талановым, вроде бы он занимается сейчас БЛМ. Я делал коробочку, в которой был комплект прецизионных сопротивлений на фторопластовой плате для поверки сего устройства.

Если уж очень приспичит и вы найдете оригинальную ячейку, то могу дать погонять электрометр от прецизионной системы дозиметрии. У него входной ток 6 фА. и разрешение в 10фА. на первом диапазоне до 50пА.

2. Что все уперлись в ИИ. Для решения такой задачи, то есть нахождения и идентификации определенного объекта в условиях неоднородной информации отработаны отличные статистические методы в радиолокации. Не надо везде совать ИИ. Это не панацея.

Спасибо за ценную информацию. С Галиной Дмитриевной ещё не общался. С Талановым попробую договориться, но только через пару недель (по возвращении).

Оригинальные ячейки постараюсь добыть к концу года. За "дать погонять" буду весьма благодарен. MinION мне уже дали погонять, но у него ПО полностью закрытое и каждый пробный прогон требует полного перезапуска компа. Поэтому отрабатывать регенерацию его ячеек весьма затруднительно. А взломать некому.

 

Почему все (компания Oxford Nanopore Technologies) упёрлись в ИИ - не знаю. Наверное, они просто не знакомы с применяемыми в России статическими методами в радиолокации.

[Leka 0]

Кстати, какая все-таки емкость ячейки?

Шаг 1мм, напряжение из-за пробоя не более 100мВ, напрашивается вывод, что емкость ячейки ~~ нанофарады. Тогда постоянная времени ячейки ~~ секунды. Уместно в таком случае говорить об измерении тока с частотой несколько кГц? 

Изменено 28 октября, 2019 пользователем Leka

[Leka 0]

В инете попалось: удельная емкость БЛМ 2...10нФ/мм^2, пробивное напряжение 150...300мВ.

Имхо, такая большая емкость ячейки (нанофарады) - ключевой момент при разработке схемы считывания.

 

 

[genseq 0]

2 часа назад, Leka сказал:

Кстати, какая все-таки емкость ячейки?

Шаг 1мм, напряжение из-за пробоя не более 100мВ, напрашивается вывод, что емкость ячейки ~~ нанофарады. Тогда постоянная времени ячейки ~~ секунды. Уместно в таком случае говорить об измерении тока с частотой несколько кГц? 

 

Толщина изолятора (мембраны) составляет примерно 8 нм. Отсюда и возможность пробоя при напряжении больше 100 mV (>12 mV/nm). Диаметр закрываемой мембраной отверстия на лунке - 100 мкм. Шаг 1,27 мм - это расстояние между контактами на площадке с LGA.

[Leka 0]

4 minutes ago, genseq said:

Диаметр закрываемой мембраной отверстия на лунке - 100 мкм

Тогда емкость получается 16...80пФ. 

[controller_m30 1]

21 час назад, genseq сказал:

на величину тока влияют не одиночные нуклеотиды, и даже не их димеры или тримеры, а четвёрки нуклеотидов. Т.е. изменение тока может иметь 256 градаций.

Если предположить что отдельный нуклеотид это резистор, то получается так, что в поре одновременно находится 4 резистора включенных параллельно (или последовательно?), и измеряемый ток это общее сопротивление такой четвёрки. Таких резисторов в цепи тысячи. Цепь движется через пору, при этом когда из неё выходит один резистор, то одновременно заходит другой, и сопротивление четвёрки меняется только на разность между пришедшим и покинувшим пору резисторами. 

И нам нужно, сопоставляя данные измерений движущейся цепочки, вычислить каждый отдельный резистор...

 

На картинке: верхний ряд - цепочка нуклеотидов-резисторов. Внизу сумма сопротивлений групп из 4 резисторов, при их последовательном движении через пору.

Например первое измерение даёт сопротивление 10 (красная ячейка). Далее пору покидает нуклеотид 1, а заходит тоже 1-й - и второй замер показывает тоже самое сопротивление (желтая ячейка). И сопротивление не изменилось! Это можно интерпретировать по разному.

Спойлер

 

Если вдруг подберётся последовательность резисторов 1,2,3,4,1,2,3,4...1,2,3,4 - то показания сопротивления (и тока) будут стоять как вкопанные...

Спойлер

А это может быть интерпретировано как замедление движения цепи, или остановка, или обрыв. Даа...

А чтоб понять что это за загадочный "простой" движения - нужно сопоставить рядом расположенные участки с уже известными геномами, и только сравнив их прийти к выводу, что вот здесь во всех геномах есть участок, интерпретируемый как остановка движения. И это нормально. Или же решить что это брак, и нужно проводить опыт сначала...

В общем при таком способе измерения, действительно желателен какой-то ИИ, с огромной базой данных о геномах, чтобы "кумекать" над возникающими тут и там "белыми пятнами".

И даже становится понятно, зачем буржуйский измеритель должен быть всегда подключен к интернету. Он без него просто ничего путёвого не покажет.

 

Изменено 28 октября, 2019 пользователем controller_m30
уточнение

[Doka 1]

genseq

а не могли бы вы более подробно описать как строится эксперимент (секвенирование ДНК) в целом?..

вот у них есть ячейка FLONGLE за ~$2k, её вставляют в minION за ~$1k, который по USB 3.0 подключается к ноутбуку,

а дальше какие-то приборы за астрономические суммы: GridION, PromethION - они тоже обязательная часть цепочки секвенирования ДНК?

 

в рамках вашей задачи аналог какого прибора НанопорТех Вы хотите разработать?..

 

[genseq 0]

1 час назад, Doka сказал:

genseq

а не могли бы вы более подробно описать как строится эксперимент (секвенирование ДНК) в целом?..

вот у них есть ячейка FLONGLE за ~$2k, её вставляют в minION за ~$1k, который по USB 3.0 подключается к ноутбуку,

а дальше какие-то приборы за астрономические суммы: GridION, PromethION - они тоже обязательная часть цепочки секвенирования ДНК?

в рамках вашей задачи аналог какого прибора НанопорТех Вы хотите разработать?..

Ячейки FLONGLE стоят $99. Пробоподготовка одной пробы - примерно столько же. Если эти ячейки использовать многократно, да ещё и пробоподготовку для них делать на своих реактивах, то стоимость одного запуска вполне может опуститься до 1000 руб.

Если учесть, что FLONGLE (адапторная вставка к MinION для уменьшенных ячеек) в Россию не поставляется, то нужно ориентироваться на разработку её аналога. А если это для наших специалистов слишком сложно, то на устройство, которое позволит экспериментировать если не с секвенированием, то хотя бы с регенерацией ячеек. С перспективой его усовершенствования и доработки до настоящего секвенатора.

Подробности технологии нанопорового секвенирования описаны на сайте, с которого вы взяли картинку.