Jump to content

    

Реверс-инжиниринг ячеек нанопорового секвенатора

Recommended Posts

09.11.2021 в 13:29, genseq сказал:

Сенсорный чип находится на отдельной плате, легко извлекаемой из ячейки. Кроме этого чипа на плате есть ещё какая-то мелочёвка и двухрядный разъём с пинами, которыми плата ячейки вставляется разъём секвенатора (в MinION). Похоже, нужно прорисовать схемы двух плат - ячейки (сенсорный чип с дополнительными компонентами) и секвенатора (FPGA Xilinx Spartan-6, LT3022, LT3029, LTC6655BHMS8-2.5#TRPBF, Cypress FX3 и т.п.). 

Предполагаю, что платы эти сделаны по многослойной технологии (может 10 слоёв, а то и 20 - особенно та плата где FPGA), и чтобы прорисовать схему соединений - нужно получить изображение каждого слоя, и потом сопоставляя изображения всех слоёв - нарисовать схему.

Далее, для проверки того что схему поняли верно, по полученным данным заказывается заводу новая плата, на неё ставятся снятые ранее компоненты, и это проверяется в работе.

При проверке может выясниться что схема считана не верно (или что-то перепутали в соединениях, или недосмотрели, или не хватает знаний по применяемым материалам, и т.д). Тогда покупается ещё один оригинальный прибор, и вновь послойно "реверс-инжинирится", а потом и проверяется. И так до тех пор, пока не начнёт работать. Не лишне, если эту работу сразу будет делать технолог по производству печатных плат, чтобы разобраться в нюансах, которые только технологам и известны.

 

В общем, только "прорисовать схему" может обойтись в несколько тысяч долларов, а также затраты времени на доставание новых оригинальных приборов, ожидание изготовления испытательных плат, и демонтаж/монтаж компонентов. 

 

А раз речь идёт о приличных расходах, то в интересах в первую очередь самого ТС - официально оформить отношения по данной исследовательской работе между заказчиком и исполнителями. И я бы настоятельно рекомендовал оформить их официально.

Дело даже не в том, что производитель может посчитать такую деятельность нарушением своих прав (особенно если при покупке заключался соотв.договор). А при офиц.оформлении можно рассчитывать на защиту государства.

Но дело ещё и в том, что в случае успеха, проделанная ТС организационная работа может легко стать объектом купли-продажи третьих лиц, поскольку ТС никаких прав на проделанную работу не оформлял. В результате у ТС будут потраченные впустую личные деньги и время, и разочарование в результате.

 

Правда как это можно оформить официально - надо консультироваться с юристами.

Share this post


Link to post
Share on other sites

a123-flex
3 часа назад, controller_m30 сказал:

В общем, только "прорисовать схему" может обойтись в несколько тысяч долларов, а также затраты времени на доставание новых оригинальных приборов, ожидание изготовления испытательных плат, и демонтаж/монтаж компонентов. 

Читайте тему внимательнее - у ТС уже на макетке система работает) Делить уже нечего) 

12.11.2021 в 13:50, yes сказал:

так как через пору "пролазит" единовременно 5(?) нуклеотидов и поэтому по току нельзя определить тот самый нуклеотид - наверно нужно "сворачивать" отсчеты со всеми возможными вариантами ДНК - для этого CUDA наверно и нужна. и лезут они с разной скоростью наверно - то есть опорную последовательность нужно еще и по времени, а не по коду искать (классическая задача статистической радиотехники - хе-хе)

В локации мы делаем свертку со своим единственным известным нам сигналом. А тут нет опорного сигнала. 

Имхо эта задача неплохо под ПЛИС подходит.

Share this post


Link to post
Share on other sites

genseq

Расшифровка сигнала (перевод сырых данных сенсора в последовательность оснований ДНК) называется бейзколлингом. Может проводиться on-line, с помощью встроенной в фирменное ПО программы Guppy. Тогда в записываемом секвенатором файле FAST5 содержатся и записи последовательностей отдельных ридов (читаемых фрагментов ДНК). Но при нехватке вычислительных мощностей запись можно делать без расшифровки. И потом обрабатывать её той же Guppy, или программами сторонних разработчиков.

В этом году появилась новая версия Guppy, с бейзколлером Bonito. Теперь можно проводить расшифровку тремя способами - очень быстро (но с низкой точностью), не очень быстро (но и не очень точно), и очень медленно, но максимально точно. В последнем случае точность секвенирования превысила 99%. Такую точность обеспечил новый алгоритм, разработанный магистрантом из Санкт-Петербурга. И предложенный, наверное, руководителем его работы для расшифровки голосовых сообщений. Этот алгоритм позволил компании Oxford Nanopore Technologies вырваться в лидеры геномных гонок, но фамилия того парнишки была упомянута только один раз, в перечне соавторов первой публикации о Bonito. И теперь о российских корнях этой фазы геномной революции не вспоминают.

Так что в России можно найти лучших в мире специалистов по бейзколлингу, но для начала нужно найти хороших схемотехников, сделать гаджет для считывания сырых сигналов с ячеек секвенатора, получить эти сырые данные, и уже потом напрягать спецов по искусственному интеллекту, способных написать (или переписать) аналог Bonito. И пусть только попробуют обвинить их в воровстве! 

 

Выдержка из прошлогодней переписки:

Кстати, об ИИ для обработки выдаваемых секвенатором данных.
Самая лучшая программа для этого (bonito) появилась около года назад:
 
Основана на алгоритме, предназначенном для синтеза и распознавания речи. В соавторах числится Беляев Станислав Валерьевич из Санкт-Петербургской школы физико-математических и компьютерных наук, защитивший в этом году магистерскую диссертацию на тему «Неавторегресионная конволюционная модель для задачи генерации речи»:
 
Edited by genseq

Share this post


Link to post
Share on other sites

blackfin
1 hour ago, genseq said:

..., но для начала нужно найти хороших схемотехников, сделать гаджет для считывания сырых сигналов с ячеек секвенатора, получить эти сырые данные, и уже потом напрягать спецов ...

Для начала, вам нужно переформулировать вашу задачу, чтобы она была понятна "хорошим схемотехникам".

 

Для этого нужно просто указать, электрические параметры этих "сырых сигналов".

То есть нужно указать:

- полосу частот сигналов (Гц);

- максимальную и минимальную амплитуду сигналов (Вольт);

- точность, с которой нужно измерять сигналы (соотношение - сигнал/шум);

- выходное сопротивление источника сигналов (Ом);

- количество источников сигналов (шт).

 

Share this post


Link to post
Share on other sites

13 часов назад, a123-flex сказал:

Читайте тему внимательнее - у ТС уже на макетке система работает) Делить уже нечего) 

Откуда у ТС макет устройства, если он только ищет спецов? По тексту следует, что есть макетная плата с FPGA.

11.11.2021 в 20:53, genseq сказал:

С доступными чипами не получится. У них отсутствует возможность изменения полярности электродов. Для понимания можно, конечно, повозиться и с ними. Но возиться некому. Я из биохимиков, и профессионально ввязаться смогу только в "мокрую" часть разработки.

А зачем нужно менять полярность? Вы предполагаете, что это приведёт к очистке? Так ведь используется раствор из многих веществ, и вероятно все они как-то взаимодействуют с электродами.

Предположим что "+" находится на платиновых электродах, а "-" на общей подложке, и вещества каким-то образом проявляют локальную активность вокруг электродов. Если поменять полярность, то те-же вещества перенесут свою активность с электродов на общую подложку. Мне кажется примерно такое.

Share this post


Link to post
Share on other sites

09.11.2021 в 13:29, genseq сказал:

Сенсорный чип находится на отдельной плате, легко извлекаемой из ячейки. Кроме этого чипа на плате есть ещё какая-то мелочёвка и двухрядный разъём с пинами, которыми плата ячейки вставляется разъём секвенатора (в MinION). Похоже, нужно прорисовать схемы двух плат - ячейки (сенсорный чип с дополнительными компонентами) и секвенатора (FPGA Xilinx Spartan-6, LT3022, LT3029, LTC6655BHMS8-2.5#TRPBF, Cypress FX3 и т.п.). 

 

Ячейка, вид снизу.

А где на этой плате сенсорный чип? По документу от AD это 256 канальный сенсор, и у него должно быть как минимум 256 ножек к электродам + какие-то ножки служебные. А на фото 8-ми и 5-ти ногие детали.

Или это тот прямоугольник залитый герметиком? Если да, то его не пробовали выпаивать и впаивать на место? Он после этого работает? Или он обработан какими-то химикатами, и паять его и вообще что-либо на этой плате нежелательно? Что будет если на сенсор попадёт спиртовой флюс для пайки, или просто его "лапнуть" руками?

Share this post


Link to post
Share on other sites

genseq
31 минуту назад, controller_m30 сказал:

А где на этой плате сенсорный чип?

Сенсорный чип слева. Контактная площадка у него с противоположной стороны (BGA). На массив BGA припаивается кремниевая пластина с лунками и электродами. Такая технология стыковки электронного чипа с накладкой ограничивает шаг электродов минимально возможным шагом BGA (0,1 мм) и не позволяет уменьшить размеры. Накладка легко отпаивается, так что при желании такие чипы можно использовать и для других целей. Они содержат 512 активных сенсорных пикселов с мультиплексорами 1:4. Там же, похоже, находится и АЦП. Усиливаемые и оцифровываемые сигналы - фемтоамперные. Точнее - на уровне теплового шума. При открытой нанопоре ток составляет примерно 50 pА, но верхний диапазон может быть и выше - до 200 pA. Напряжение на электродах обычно не превышало 100 mV, но в последнее время доводят его до 180 mV (выше - электрический пробой, ниже - меньше ток). Скорость прохода ДНК через пору сначала увеличивали, и довели до 450 оснований в секунду, но сейчас опять понизили до 200 оснований. Утверждают, что электроника позволяет довести скорость до 1000 оснований в секунду. Это значит, что частота опроса сенсоров (~10 опросов на основание) может достигать 10 килогерц (для каждого из 512 сенсоров). Т.е. чип или должен работать на частоте 5 мегагерц, или его информация передаётся параллельно, по нескольким менее высокочастотным каналам. Хотя в электронике я не разбираюсь, а в арифметических подсчётах могу ошибаться.

 

Кстати, о фотографии. Это задняя сторона ячейки, на которой у чипа видно потрескавшееся покрытие. Это что-то вроде резины, легко повреждаемой даже ногтем. Скорее всего, она служит защитой от электромагнитных излучений. Чип очень чувствителен, и на начальной стадии разработки прибора были проблемы с наводками, создаваемыми встроенным в прибор микровентилятором.   

 

 

Share this post


Link to post
Share on other sites

gte
22 часа назад, genseq сказал:

Они содержат 512 активных сенсорных пикселов с мультиплексорами 1:4. Там же, похоже, находится и АЦП

Как по Вашему, мультплексоры служат для увеличения количества считываемых ячеек или для увеличения времени жизни сенсора?

22 часа назад, genseq сказал:

С доступными чипами не получится. У них отсутствует возможность изменения полярности электродов.

Изменение полярности, случайно, не для сброса заряда с ячейки и/или расширения диапазона напряжения?

Почему обязательно необходимо так минитюаризовать, а использовать гораздо большие размеры? По крайней мере, для 512 ячеек.

 

Share this post


Link to post
Share on other sites

genseq

Первоначально мультиплексоры были необходимы для того, чтобы после проверки отключать неработоспособные лунки. Пригодны для секвенирования только лунки, содержащие в бислойной липидной мембране (БЛМ) одну нанопору (трансмембранный белок, формирующий ионный канал) - не больше, и не меньше. При случайном встраивании таких белков в БЛМ доля работоспособных лунок даже теоретически не может превышать 50%. Правда, впоследствии было установлено, что прямой потенциал стимулирует встраивание нанопор, а обратный - предотвращает. Если отслеживать встраивание нанопоры (повышение проводимости) и менять полярность потенциала сразу после регистрации её встраиввания, то удаётся повысить долю работоспособных лунок до 80...90%. И значительно увеличить количество получаемой каждым сенсором информации при помощи переключения сенсора с одной лунки на другую. Дело в том, что нанопоры, на которые подаётся потенциал, быстро портятся -   затыкаются слишком крупными молекулами (например, двунитевой ДНК).  И такие "затычки" можно извлечь из пор изменением полярности потенциала. Так что реверс полярности нужен как на стадии подготовки ячейки к работе (для оптимизации встраивания нанопор в мембрану), так и для регенерации инактивированных "затычками" пор.

Стоимость сенсорных чипов пропорциональна их размерам. Отсюда следует необходимость их миниатюризации.

Share this post


Link to post
Share on other sites

gte
1 час назад, genseq сказал:

Так что реверс полярности нужен как на стадии подготовки ячейки к работе (для оптимизации встраивания нанопор в мембрану), так и для регенерации инактивированных "затычками" пор.

Понятно.

Цитата

Стоимость сенсорных чипов пропорциональна их размерам. Отсюда следует необходимость их миниатюризации.

Из статьи я понял, что ячейка продается за $900.

Исходя из стоимости сторонней ADAS1131 (256 каналов)  $304 при 1000 штук, 512 канальные, да с дополнительным коммутатором, будет стоить еще дороже, на сам чип с лунками и покрытие остается не так уж много учитывая изготовление, расходы на разработку и поддержание, прибыль.

Share this post


Link to post
Share on other sites

yes
On 11/14/2021 at 1:06 AM, a123-flex said:

Читайте тему внимательнее - у ТС уже на макетке система работает) Делить уже нечего) 

В локации мы делаем свертку со своим единственным известным нам сигналом. А тут нет опорного сигнала. 

Имхо эта задача неплохо под ПЛИС подходит.

задача поиска - то есть выбора опорного сигнала среди множества (достаточно большого, наверно, для вариантов ДНК - но естественно не вся цепочка, а склейки по 20-30 (?) оснований)

upd ну и под куду явно лучше чем под ПЛИС, тем-более микроскопический XC6SLX9 

 

 

 > и менять полярность потенциала сразу после регистрации её встраиввания, то удаётся повысить долю работоспособных лунок до 80...90%.

то есть предполагаете, что возможность поменять полярность существует для каждой лунки индивидуально?

я то понял так, что есть некий общий электрод на котоый подается смещение (опорный потенциал), а микросхема с ее 2048 входами/мультиплексорами только измеряет ток. все ее платиновые лунки имеют приблизительно один потенциал - то есть допустимо стекания тока через эти входы

------------

сомневаюсь в возможности выдавать "обратный" ток индивидуальной лункой потому что требуется "силовая" относительно входных пикоамперных токов схемотехника, которая может (и должна) изгадить измерения в рабочем режиме

 

 

Share this post


Link to post
Share on other sites

Leka
1 hour ago, gte said:

на сам чип с лунками и покрытие остается не так уж много учитывая изготовление, расходы на разработку и поддержание, прибыль

Нужно учитывать, что обычно для сложных чипов, продажная цена на порядки больше себестоимости изготовления, и монополистам не выгодно предлагать решения на базе простых чипов и дешевой технологии.

Те практическое отсутствие более простого (в тч по схемотехнике) и дешевого (в тч по техпроцессу) решения - не означает, что оно теоретически невозможно.

Share this post


Link to post
Share on other sites

gte
39 минут назад, yes сказал:

я то понял так, что есть некий общий электрод на котоый подается смещение (опорный потенциал), а микросхема с ее 2048 входами/мультиплексорами только измеряет ток. все ее платиновые лунки имеют приблизительно один потенциал - то есть допустимо стекания тока через эти входы

Как вариант. Если процесс "проскальзывания" достаточно медленный, то каждая лунка набирает потенциал несколькими порциями - "проскальзываниями" и процесс в лунке прекращается. Когда все лунки прекратят работу, происходит процесс сброса потенциала всех лунок и процесс перезапускается. Я бы начинал с построения функциональной схемы, изучения того, как происходит процесс считывания, а уж потом думал, куда двигаться далее.

 

16 минут назад, Leka сказал:

Нужно учитывать, что обычно для сложных чипов, продажная цена на порядки больше себестоимости изготовления, и монополистам не выгодно предлагать решения на базе простых чипов и дешевой технологии.

Так и я об этом. Сомневаюсь в альтруизме, например AD, поэтому и предполагаю, что вклад того, что остается на сами сенсоры не очень большой, особенно, если их так же делает сторонняя фирма. Прибыль хорошая у производителя секвенатора MinION должна же быть.

Share this post


Link to post
Share on other sites

RobFPGA
4 hours ago, gte said:

Из статьи я понял, что ячейка продается за $900.

Исходя из стоимости сторонней ADAS1131 (256 каналов)  $304 при 1000 штук, 512 канальные, да с дополнительным коммутатором, будет стоить еще дороже, на сам чип с лунками и покрытие остается не так уж много учитывая изготовление, расходы на разработку и поддержание, прибыль.

Пока не ясно вообще стоит ли там какой либо ADAS* . В даташитах пишут  что ADAS* пакуется в 15 mm × 15 mm, CSP_BGA корпуса, а на фото явно не такое. Так что навряд ли там стоит что то стандартное.  А даже если и стоит то все одно управление сенсором как и контроль напряжения и полярности скорее всего реализовано внутри самого сенсора. Как наверное и предварительный усилитель и коммутаторы.    

С технической точки начинать надо с полной схемы и сбора диаграмм сигналов на доступных выводах. FPGA тут скорее никакой обработки сигнала не делает - это скорее всего простой адаптер интерфейсов из USB в что то типа SPI/I2C для контроля и из LVDS входа данных на USB. Если софт "открыт" то можно увязать функционал записи/чтения с сигналами на выводах FPGA и ASICов. И если железо  сенсора позволяет индивидуальный контроль ячеек то IMHO проще найти как этим управлять чем ваять такое железо самому с нуля.    

С практической точки IMHO эта работа по реверсу чисто на личный "интерес", без каких либо перспектив. Из презентаций на сайте видно что процесс встройки и контроля нанопор отнюдь не тривиален даже на чистый чип. В доках на ячейки пишут что до 1/4-1/3 ячеек может быть сразу "нерабочими".  Ну и при цене расходной ячейки только с сенсором (без конвертора) в 90$ IMHO даже экономический смысл этого не ясен. 

Share this post


Link to post
Share on other sites

Join the conversation

You can post now and register later. If you have an account, sign in now to post with your account.

Guest
Reply to this topic...

×   Pasted as rich text.   Paste as plain text instead

  Only 75 emoji are allowed.

×   Your link has been automatically embedded.   Display as a link instead

×   Your previous content has been restored.   Clear editor

×   You cannot paste images directly. Upload or insert images from URL.