[genseq 0]

Есть желание разработать простейший секвенатор - прибор для секвенирования ДНК. Некоторые подробности есть здесь: https://habr.com/ru/post/455156/

А если не разработать, то хотя бы сформулировать ТЗ на его разработку. При этом хорошо бы максимально использовать уже готовые компоненты, т.е. готовую рабочую ячейку от FLONGLE ( https://nanoporetech.com/products/flongle )подключить к готовому же одноканальному усилителю пикоамперных токов. Например: http://www.tecella.com/. Фактически - сделать контактную площадку (10х13 контактов) типа LGA с шагом 1,27 мм, и подключить 126 контактов через мультиплексор (4 контакта из 130 подключаются к референсному электроду) к одному выходу. Причём на этот выход желательно поставить чопперный предусилитель (см. аттач).

Отсюда - вопросы. 1. Можно ли для этого использовать FPGA? 2. Если можно, то какие FPGA лучше всего подойдут для этой цели? 3. Можно ли и предусилитель сделать не внешним, а закодировать его в FPGA?

Извините, если вопросы слишком наивные. Я из биологов: https://1drv.ms/v/s!Aj-K-u-yGV92mj8vFBGYhQn_vX9P?e=VL4Nw6

 

Transimpedance Amplifier - 2018.pdf

[MegaVolt 25]

19 минут назад, genseq сказал:

подключить 126 контактов через мультиплексор (4 контакта из 130 подключаются к референсному электроду) к одному выходу.

Сразу поправка. Мультиплексор это аналоговая штука. Мультиплексоры в FPGA цифровые. Т.е. это совершенно разные вещи и сделать на FPGA аналоговый мультиплексор нельзя. Вот управлять этим мультиплексором от FPGA можно. Аналоговые мультиплексоры можно посмотреть например тут: https://www.analog.com/en/parametricsearch/10624

Цитата

Причём на этот выход желательно поставить чопперный предусилитель (см. аттач).

Не понятно. То ли ставить чоппер то ли готовый который есть по ссылке.

Цитата

Можно ли и предусилитель сделать не внешним, а закодировать его в FPGA?

Увы тоже нельзя. Предусилитель это тоже аналог. Придётся делать всё равно внешним. 

 

 

По хорошему отталкиваться нужно от того какие токи у вас нужно измерять. И как быстро переключать каналы.

[iosifk 3]

2 часа назад, genseq сказал:

Отсюда - вопросы. 1. Можно ли для этого использовать FPGA?

ПЛИС - схема цифровая.

А вот ПАИС - аналого-цифровая. Это программируемая Аналоговая микросхема. И там можно "закодировать" аналоговые обрабатывающие схемы. Но дело в том, что усилители в ней плохие. Правда, если поищите, то в каких-то новых ПЛИС есть АЦП, кажется так... Но они не могут принципиально быть высокого качества. 

[Plain 167]

3 часа назад, genseq сказал:

вопросы слишком наивные

Если всё сплошь запатентовано, к чему эта тема?

[genseq 0]

34 минуты назад, iosifk сказал:

ПЛИС - схема цифровая.

А вот ПАИС - аналого-цифровая. Это программируемая Аналоговая микросхема. И там можно "закодировать" аналоговые обрабатывающие схемы. Но дело в том, что усилители в ней плохие. Правда, если поищите, то в каких-то новых ПЛИС есть АЦП, кажется так... Но они не могут принципиально быть высокого качества. 

Спасибо за информацию. Поискал информацию про ПАИС. Похоже, все (или не все?) пути ведут в Зеленоград: https://dcsoyuz.ru/support/create_project

Там уже есть и готовые микросхемы с мультиплексированием до 64 аналоговых каналов, и конфигурируемые операционные усилители на (почти) любой вкус. Нужно только подготовить грамотное ТЗ и заказать выполнение проекта (и найти деньги на его оплату). Но начинать нужно с ТЗ. При этом сразу возникает вопрос - что лучше: два зеленоградских 64-канальных мультиплексора или четвёрка 32-канальных мультиплексоров серии ADG731? И стоит ли ориентироваться на разработку специального АЦ БМК, или проще поставить на плату обычный операционный усилитель типа LMC662 или OPA2376 (см. статью бразильцев)? 

MAE_fambrini2017.pdf

[iliusmaster 5]

"Во все тяжкие" отправились биологи.

ТЗ от биолога должно быть составлено в биологических терминах, которые потом с электронщиком можно превратить в "электрические" термины. 

Пример. 

Биолог: "При полимеразной реакции происходит присоединение нуклеотидтрифосфата к цепи ДНК с одновременным высвобождением пирофосфата и/ или специальной метки. Пирофосфат или метка обладают такими то свойствами физическими или химическими. Вот эту метку нам нужно четко детектировать. 

При полимеразной цепной реакции цепочка ДНК проходит через пору, образованную альфа гемолизином. При этом в зависимости от типа нуклеотида меняется ток, протекающий через растворы, разделенные мембраной и соединенные этой порой. Величина тока такая-то. Шум такой-то, допустимая погрешность определения тока для уверенного опознавания типа нуклеотида - такая-то."

 Потом вы рассчитываете уровень возможных сигналов, соотношение сигнал/шум и танцуете дальше. 

Применительно к конкретному методу, что используют Nanopore, можно использовать любой подходящие трансимпедансный усилитель на основе ОУ lmp7721, opa128/129, opa111,ada4530,lmc6001  с большим по величине резистором в обратной связи. 

Проблема то применительно к этому методу не связана с преобразованием сигнала, так-как по сути своей это преобразователь ток-напряжение. Проблема связана с получением хитрой поры, что и запатентовано. 

Будут вопросы - обращайтесь.  Я тут искалеченный электроникой биохимик или биохимией электроник. Помогу чем смогу.

[genseq 0]

Спасибо. Приятно иметь дело со знающим специалистом. Даже искалеченным электроникой (или биохимией).

Проблема не только в поре. Разбираться придётся и с мембраной, и с составом электролита, и с электродами, и с хеликазой, и со структурой адапторов, и с бейзколлером, и с прочим ПО. Здесь обсуждается только вариант устройства, необходимого для освоения регенерации и многократного использования готовых ячеек (FLONGLE). Для этого нужно отработать их отмывку от старых мембран, гидрофобизацию поверхности лунок фторсиланами, регенерацию мембран встраивание в них ионных каналов, близких по проводимости к CsgG. Получить саму CsgG, со всеми описанными в патентах модификациями, не так уж и сложно (и есть кому). Специалисты по мембранам ("бислойщики") с богатым опытом изучения белковых ионных каналов тоже имеются. И у них уже есть хорошие усилители даже не пикоамперных, а фемтоамперных токов. Причём работать они привыкли исключительно в клетках Фарадея. Иначе наводки всё портят. Но для инициализации такой работы нужно сделать простенькую систему считывания ионной проводимости с 126 лунок, электроды которых подключены к массиву золочёных контактов (10х13) на нижней стороне ячейки FLONGLE. Причём добыть такие ячейки будет не так то просто, поскольку FLONGLE попал в санкционные списки и в Россию не поставляется. Но к этому нам не привыкать. 

В общем, речь идёт даже не о разработке устройства, пригодного для секвенирования, а о считывании довольно ощутимых изменений проводимости лунок в ячейках. Т.е. нужно отличать полностью открытые (промытые) лунки, изменение их электропроводности при формировании бислойной липидной мембраны (БЛМ), и контролировать встраивание в мембраны пор, повышающих их электропроводность до ~50 pA при 100 mV. Ещё хорошо бы иметь возможность изменения полярности напряжения, поскольку это позволяет устранить встраивание в мембраны двух и более пор. И повысить выход пригодных для секвенирования "монопоровых" лунок.  

Насчёт патентов не беспокойтесь. В России их нет, а на патенты США и Великобритании можно не обращать внимания. А если и обращать, то исключительно для пользы дела.   

Буду признателен за любые вопросы, предложения и соображения. 

[iliusmaster 5]

Так вот я к чему все это. 

1. Если вам хочется секвенировать сцелью изучать последовательности ДНК - аппаратуры море - купите и секвенируйте. 

2. Если хочется сделать аппарат для секвенирования - то какой смысл повторять уже отработанное  решение. Лучше вы сделать не сможете, потому как всегда будете отставать на шаг - другой. То есть нельзя ставить цель в точку, которая всеми уже пройдена.

3. Если хочется сделать аппарат для секвенирования - придумывайте лучше и делайте на шаг вперед. Цели ставьте тоже на шаг вперед. Тогда вы будете стремиться примерно в одну точку с конкурентами и это будет равное соревнование, в котором есть шанс победить. 

4. Так в чем история то? сделать считыватель проводимости на 126 лунок? Это как раз не очень сложно. Найдите ресурсы(финансовые), думаю что тысяч за 6-8 доларов такую шайтанку можно сделать легко быстро и непринужденно и на этом форуме найдется с десяток человек, способных на разработку такой штуки. 

Делается 8 шт. 16-канальных измерителей. 126 целевых каналов и 2 в запас на определение дрейфов и погрешностей.  Подходящие ОУ мультиплексоры АЦП, ЦАП всегда доступны. Схемотехника и ПО - не глобальной сложности.  

 

 

Вкладывать ресурсы в заведомо устаревшую разработку смысла нет. Школы нет, тогда зачем ее создавать под что-то устаревшее? 

Предложение и соображение может быть только одно - определитесь хорошо с целью, чего вы хотите достигнуть. Сделать копию секвенатора в надежде, что это будет дешевле и можно будет всех осчастливить дешевым индивидуальным геномом. Оставьте эту идею. Дешевле сделать не возможно. Потому как ваших ресурсов на создание такой системы не хватит, а у тех людей, у которых есть ресурсы - есть желание их умножить. Потому когда вы возьмете у них ресурсы и сделаете  секвенатор, они попросят вас ресурсы вернуть, да еще и с процентами.

Ставьте целью сделать такой секвенатор, чтобы со всего мира к вам прибежали и встали в очередь. Вот тут и появится шанс на что-то хорошее.

Есть бислойщики, выделятели белков, исследователи каналов, и даже фемтоамперметр заперли за решетку Фарадея.  ("Глобально то и космическую ракету мы можем сделать. Остались еще и двигателисты, и конструкторы и математики и электронщики и даже программисты вроде-бы есть. Но вот что-то не получается. Протон кончился, Ангары и Союза -5 нет. Так значит чего- то иного не хватает).

[alexunder 4]

16 hours ago, genseq said:

Есть желание разработать простейший секвенатор - прибор для секвенирования ДНК.

Вам правильно ответили, что сфокуироваться следует на аналоговой части, а ПЛИС тут уже дело десятое.

Лет 12 назад знакомые занимались протаскиванием ДНК через одну единственную дырку (сделанную удачным выстрелом электронной пушки литографа) в графеновом лепестке (сам лепесток лежал на кремниевой пластине, анизотропно протравленной с обратной стороны), который и выступал той самом мембраной. Я хорошо помню, что токи там были мизерные и, чтобы различать прохождение отдельных сегментов ДНК приходилось использовать усилитель с синхронным детектором (lock-in amplifier) типа вот такого. С усилителя и следует начать и может даже с одноканального варианта всей системы.

[genseq 0]

 Открыл ветку вчера, а уже сегодня почерпнул много нового:

1. FPGA вообще не имеют отношения к обсуждаемому вопросу (к аналоговому мультиплексору и к операционным усилителям). Нужно использовать аналоговые или аналогово-цифровые ПАИС.

2. Разработчики подобных ПАИС гнездятся в Зеленограде ( https://dcsoyuz.ru/ ), но прежде, чем к ним обращаться, нужно сформулировать ТЗ. Или хотя бы определиться с основными параметрами требуемой системы. Правда, без денег к ним лучше не соваться, но с деньгами все проблемы решаются за 6...9 месяцев. 

3. Если ориентироваться не на разработку специальной ПАИС, а на сборку системы из готовых комплектующих (что намного дешевле), то они есть. Например, аналоговые мультиплексоры на 32 канала, операционные усилители на любой вкус, и даже мультиплексоры на 5 каналов со встроенными малошумящими (чопперными)  операционными усилителями и встроенными же 24-разрядными прецизионными сигма-дельта АЦП: https://www.terraelectronica.ru/news/5807  

Похоже, нужно припаять на одну сторону платы (PCB) кусочек ((10х13) LGA/BGA из какого-нибудь коннектора для центрального процессора (с шагом контактов 1,27 мм), а на другой стороне сделать разводку этих 130 контактов на 4 мультиплексора типа ADG731 (4х32), на выходы этих мультиплексоров поставить по предусилителю, и подключить их всех к выводам мультиплексора микросхемы ADS1235 производства Texas Instruments. Это позволит обойтись без подключения специальных усилителей (что планировалось в первоначальном варианте).

Буду признателен за любые замечания и предложения. 

 

[MegaVolt 25]

1 час назад, genseq сказал:

Буду признателен за любые замечания и предложения. 

Пока не будет цифр любые фантазии с солянки из любых кубиков будут работать. 
Примерно как в задаче когда нам нужно перевезти груз. Нужно взять машину и перевезти. Очевидно. Только потом вылазят детали. Например про то что груз нужно охладлать. А размеры его таковы что по обычной дороге он не пролазит и пр....

[iliusmaster 5]

1 час назад, genseq сказал:

 

 

Сразу тонкость. 

ПРЕДУСИЛИТЕЛИ нужно ставить до мультиплексоров. Стандартные мультиплексоры не приспособлены для работы с малыми токами. Велики токи утечки и инжекция заряда присутствует.  

В общем для начала работ нужно 
1. Собрать вашу ячейку в одноканальном варианте в комплекте с системой усиления от БЛМ.

2. Снять параметры сигнала для одного канала.

- ток начальный утечки мембраны 

- шумовой ток в нормальных условиях (в отсутствие компонентов)

- шумовой ток в нормальных условиях (в присутствие компонентов)

- ток при наличии реакции 

- ток от цепочки  ДНК с большим числом ААААА(полиаденилатный конец)

- ТТТТТТТ

- ГГГГГГГГ

- ЦЦЦЦЦЦ

чтобы статистически установить примерную величину изменения сигнала от каждого типа нуклеотида.

Вот когда у вас появится табличка с параметрами в виде конкретных величин токов, вот тогда можно идти к разработчикам, чтобы они спроектировали вам оптимальную систему на много каналов.

[esaulenka 5]

3 hours ago, genseq said:

FPGA вообще не имеют отношения к обсуждаемому вопросу

Имеют, опосредственное. В тот момент, когда у вас появится много-много данных, и их надо будет затолкать в компьютер, а перед этим как-то предобработать, FPGA может пригодиться.

Я, правда, не понял, откуда в этой штуковине (даже на 100+ каналов) МНОГО данных... Там характерная скорость изменения сигнала какая предполагается? Я не биолог совсем, но мне всегда казалось, что все биохимические процессы идут довольно медленно...

 

PS а за статьи вам спасибо! Половина слов непонятна, но краем глаза посмотреть, какие сейчас космические корабли бороздят просторы биоинженерии, было очень интересно.

[genseq 0]

3 часа назад, esaulenka сказал:

Я, правда, не понял, откуда в этой штуковине (даже на 100+ каналов) МНОГО данных... Там характерная скорость изменения сигнала какая предполагается? Я не биолог совсем, но мне всегда казалось, что все биохимические процессы идут довольно медленно…

Данных монопоровый секвенатор будет выдавать сравнительно немного. Частота считывания - несколько килогерц. Для предварительных расчётов можно ориентироваться на частоту сэмплирования у 24-разрядного АЦП ADS 1235 ($4,8), равную 7,2 kSPS. Скорость прохождения ДНК через пору, определяемая скоростью работы хеликазы, может достигать 450 нуклеотидов в секунду. Т.е. на каждый нуклеотид может приходиться до 16 считываний. Это довольно неплохой показатель. Информации должно хватать для сглаживания зашумлённого тепловыми и прочими помехами графика изменения ионной проводимости нанопоры. 

Возможно, я зря нацелился на FLONGLE с его 126 сенсорными лунками. Есть варианты попроще. Например, четырёхлуночные или 16-луночные ячейки от Ionera (Германия): https://www.ionera.de/products.htm 

Но я сильно сомневаюсь, что эти многоразовые ячейки продают за копейки. А ячейки от FLONGLE одноразовые. Т.е. должны выбрасываться после использования. И скоро они (юзанные) будут вполне доступны, причём даже бесплатно. Так что лучше ориентироваться на FLONGLE. Тем более, что моя главная цель - отработка их регенерации и многократного использования. Но отрабатывать такую регенерацию невозможно без обсуждаемого здесь прибамбаса. Было бы очень неплохо использовать его и для секвенирования (считывать протекающие через нанопоры токи в диапазоне от 0,1 до 100 pA). Но боюсь, что местной публике это не под силу. И придётся ограничиться грубой регистрацией формирования БЛМ (изменения тока от нескольких наноампер до нуля) и регистрацией встраивания в мембраны нанопор, повышающих их ионную проводимость примерно до 50 pA (при 100 mV). 

[Plain 167]

Усилитель для измерения 1 фА местная публика может и на LM324 собрать, только без толку, потому как завтра и их запретят.