Jump to content

    

genseq

Участник
  • Content Count

    70
  • Joined

  • Last visited

Community Reputation

0 Обычный

About genseq

  • Rank
    Участник

Recent Profile Visitors

The recent visitors block is disabled and is not being shown to other users.

  1. Скорость протяжки в ONT довели до 450 оснований ДНК в секунду. При этом утверждали, что электроника позволяет увеличить скорость до 1000 оснований/сек. Но в этом году они сосредоточились на борьбе за качество получаемых данных и скорость уменьшили до 200 оснований/сек. Т.е. или увеличили продолжительность интегрирования заряда, или повысили качество получаемых данных посредством их суммирования и усреднения. Или и то, и другое. В каждом сенсорном пикселе чипа уже встроены малошумящие каскадные усилители, детектирующие импульсы тока (заряды, накапливаемые на пиксельных же конденсаторах). Если не ошибаюсь, АЦП тоже находятся в чипе (скорее всего, 14-разрядные).
  2. Для регенерации мембран наводки не принципиальны по причине наноамперных изменений сигнала. Для встраивания нанопор в мембрану нужно отслеживать пикоамперные изменения (от <1 pA до ~50 pA), причём с не очень высокой точностью. При таких требованиях наводками можно пренебречь. Или обойтись их простейшим экранированием.
  3. Про "нано" не писал. Только про "пико". И поминал ещё "фемто", но даже десятки fA - это уже сплошной шум. Что-то осмысленное можно "вытянуть" только при токах в сотни фемтоампер. Рабочий диапазон - от 1 до 50 pA (при 100 mV). Наноамперами ток измеряется при пробое мембраны.
  4. Рабочий диапазон и разрядность считываемых сигналов определяются параметрами сенсорного чипа. Секвенатор может задавать уровень потенциалов, подаваемых на отдельные сенсоры чипа, регулировать температуру чипа и частоту опроса его сенсоров, и передавать считываемые сигналы на компьютер. Считывающе устройство (аналог секвенатора) должно делать то же самое, но может быть проще, поскольку не нужно заморачиваться с устранением электромагнитных наводок.
  5. Так и есть. Всё доступно. Но попытки идти этим путём результата не принесли. А продолжались они больше года. Пользуясь случаем хочу поблагодарить участника этого топика baumanets за контактные данные специалиста, способного (я надеюсь) оценить трудоёмкость (стоимость и продолжительность) реверса ASIC. Сглазил. Пока сочинял эту благодарность прилетело письмо с ответом: В общих чертах я понял чего бы Вы хотели, но к сожалению это вне моей компетенции!
  6. Сенсоры чипов, используемых в компьютерных томографах, нацелены на измерение субпикоамперных токов. Это отдельный раздел микроэлектроники, в котором главное - подавление шумов, наводок и утечек. На самом высоком уровне в таких вопросах разбираются в Analog Devices (причём только два человека). Немного хуже обстоят дела в Texas Instruments. Прочие специалисты обычно даже не представляют, о чём идёт речь. Боюсь, что не просто печально. Фатально!
  7. Как раз этого мы не знаем. А без такой информации написать свою прошивку для ПЛИС невозможно. Или возможно? Буду рад ошибиться.
  8. На плате с ASIC, которая интергирована в ячейку, есть какая-то микросхемная мелочёвка (3 шт.), крупный металлический выступ (контачит с металлическим корпусом секвенатора) и разводка, которая выводится на двухрядный разъём ("папа", 16х2) шириной пол дюйма. FPGA находится на более сложной плате (плате секвенатора) с разъёмом "мамового" типа, в который вставляется ячеечный "папа": В ячейке менять ничего не нужно. Её нужно использовать многократно. А для этого придётся изучить её распиновку и попытаться заменить секвенатор отоладочной платой с FPGA. Хорошо бы не менять, а просто модифицировать ПО секвенатора. Но это, насколько я понял, слишком сложно. Проще переписать всё заново. Отсюда следует необходимость анализа распиновки ячеечной платы и замены секвенатора отладочной платой.
  9. Спасибо за прикол! Получиться может и то, и другое. Это зависит не от меня. Хотя и моя безграмотность может внести свою лепту.
  10. Для ТС (топик-стартера) всё это - хобби, заключающееся в желании сделать секвенирование доступным для всех. Причём без особых вложений в разработку. А если с вложениями, то через бюджетные гранты, не требующие отдачи. Но ввязываться в оформление грантов есть смысл только под команду, способную справиться с задачей. Сейчас главная задача - сформировать работососпособную команду. Можно решать подобные проблемы и в одиночку, но для этого требуется непризнанный гений, найти которого вряд ли удастся. Если оринетироваться на нормальных людей, то нужно разделить задачу на несколько этапов. И решать их последовательно. Первая задача - разработка вставки (платы) для анализа сигналов, которыми секвенатор (FPGA) обменивается с ячейкой (ASIC). И анализ распиновки. Т.е. определение назначения всех пинов платы с ASIC и составление datashit с подробным описанием назначения всех этих контактов. Если составить подробное описание распиновки, то количество желающих ввязаться в следующую задачу может увеличиться с одного (на первом этапе) до двух. Или даже до трёх. Вторая задача - подключение ячейки (ASIC) к отладочной плате со SPARTAN-6. И попытка запуска считывания сигналов с использованием уже имеющейся загрузочной программы. Если получится, то цена считывающего информацию гаджета будет определяться стоимостью отладочной платы. Альтернативный вариант - использование готовых (отладочных) плат с более современными FPGA и сочинение собственной загрузочной программы. Третья задача - упаковка этой платы в красивую коробочку (3D-printing) и разработка ПО для регенерации нанопоровых ячеек. Заработать денег на такой разработке вряд ли удастся. Зато удастся создать хороший задел для разработки отечественного нанопорового секвенатора. Но это уже за казённые деньги.
  11. Клонировать секвенатор пока не нужно, поскольку восстановлению ячеек это не поможет. Для регенерации бислойных липидных мембран на лунках ячеек нужно устройство, позволяющее наблюдать за изменением их электропроводности. Т.е дающее простую картинку с 256 градациями яркости или с переходами цвета (hot-map), позволяющее увидеть изменение сопротивления лунок с 0 до 1...2 гигаом. Или обнаружить неработоспособные сенсоры. При этом нужно минимизировать электрохимическую коррозию сенсорных электродов. Иначе эти наблюдения могут угробить ячейки. Для встраивания в мемраны ионных каналов нужно отслеживать изменение тока в лунках с <1 pA до ~50 pA при +100 mV, и сразу поле встраивания поры отключать подаваемый потенциал ("посенсорно"). Но лучше - менять его полярность (подавать -100 mV).
  12. Первоначально мультиплексоры были необходимы для того, чтобы после проверки отключать неработоспособные лунки. Пригодны для секвенирования только лунки, содержащие в бислойной липидной мембране (БЛМ) одну нанопору (трансмембранный белок, формирующий ионный канал) - не больше, и не меньше. При случайном встраивании таких белков в БЛМ доля работоспособных лунок даже теоретически не может превышать 50%. Правда, впоследствии было установлено, что прямой потенциал стимулирует встраивание нанопор, а обратный - предотвращает. Если отслеживать встраивание нанопоры (повышение проводимости) и менять полярность потенциала сразу после регистрации её встраиввания, то удаётся повысить долю работоспособных лунок до 80...90%. И значительно увеличить количество получаемой каждым сенсором информации при помощи переключения сенсора с одной лунки на другую. Дело в том, что нанопоры, на которые подаётся потенциал, быстро портятся - затыкаются слишком крупными молекулами (например, двунитевой ДНК). И такие "затычки" можно извлечь из пор изменением полярности потенциала. Так что реверс полярности нужен как на стадии подготовки ячейки к работе (для оптимизации встраивания нанопор в мембрану), так и для регенерации инактивированных "затычками" пор. Стоимость сенсорных чипов пропорциональна их размерам. Отсюда следует необходимость их миниатюризации.
  13. Сенсорный чип слева. Контактная площадка у него с противоположной стороны (BGA). На массив BGA припаивается кремниевая пластина с лунками и электродами. Такая технология стыковки электронного чипа с накладкой ограничивает шаг электродов минимально возможным шагом BGA (0,1 мм) и не позволяет уменьшить размеры. Накладка легко отпаивается, так что при желании такие чипы можно использовать и для других целей. Они содержат 512 активных сенсорных пикселов с мультиплексорами 1:4. Там же, похоже, находится и АЦП. Усиливаемые и оцифровываемые сигналы - фемтоамперные. Точнее - на уровне теплового шума. При открытой нанопоре ток составляет примерно 50 pА, но верхний диапазон может быть и выше - до 200 pA. Напряжение на электродах обычно не превышало 100 mV, но в последнее время доводят его до 180 mV (выше - электрический пробой, ниже - меньше ток). Скорость прохода ДНК через пору сначала увеличивали, и довели до 450 оснований в секунду, но сейчас опять понизили до 200 оснований. Утверждают, что электроника позволяет довести скорость до 1000 оснований в секунду. Это значит, что частота опроса сенсоров (~10 опросов на основание) может достигать 10 килогерц (для каждого из 512 сенсоров). Т.е. чип или должен работать на частоте 5 мегагерц, или его информация передаётся параллельно, по нескольким менее высокочастотным каналам. Хотя в электронике я не разбираюсь, а в арифметических подсчётах могу ошибаться. Кстати, о фотографии. Это задняя сторона ячейки, на которой у чипа видно потрескавшееся покрытие. Это что-то вроде резины, легко повреждаемой даже ногтем. Скорее всего, она служит защитой от электромагнитных излучений. Чип очень чувствителен, и на начальной стадии разработки прибора были проблемы с наводками, создаваемыми встроенным в прибор микровентилятором.
  14. Расшифровка сигнала (перевод сырых данных сенсора в последовательность оснований ДНК) называется бейзколлингом. Может проводиться on-line, с помощью встроенной в фирменное ПО программы Guppy. Тогда в записываемом секвенатором файле FAST5 содержатся и записи последовательностей отдельных ридов (читаемых фрагментов ДНК). Но при нехватке вычислительных мощностей запись можно делать без расшифровки. И потом обрабатывать её той же Guppy, или программами сторонних разработчиков. В этом году появилась новая версия Guppy, с бейзколлером Bonito. Теперь можно проводить расшифровку тремя способами - очень быстро (но с низкой точностью), не очень быстро (но и не очень точно), и очень медленно, но максимально точно. В последнем случае точность секвенирования превысила 99%. Такую точность обеспечил новый алгоритм, разработанный магистрантом из Санкт-Петербурга. И предложенный, наверное, руководителем его работы для расшифровки голосовых сообщений. Этот алгоритм позволил компании Oxford Nanopore Technologies вырваться в лидеры геномных гонок, но фамилия того парнишки была упомянута только один раз, в перечне соавторов первой публикации о Bonito. И теперь о российских корнях этой фазы геномной революции не вспоминают. Так что в России можно найти лучших в мире специалистов по бейзколлингу, но для начала нужно найти хороших схемотехников, сделать гаджет для считывания сырых сигналов с ячеек секвенатора, получить эти сырые данные, и уже потом напрягать спецов по искусственному интеллекту, способных написать (или переписать) аналог Bonito. И пусть только попробуют обвинить их в воровстве! Выдержка из прошлогодней переписки: Кстати, об ИИ для обработки выдаваемых секвенатором данных. Самая лучшая программа для этого (bonito) появилась около года назад: GitHub - nanoporetech/bonito: Bonito - A PyTorch Basecaller for Oxford Nanopore Reads https://github.com/nanoporetech/bonito Основана на алгоритме, предназначенном для синтеза и распознавания речи. В соавторах числится Беляев Станислав Валерьевич из Санкт-Петербургской школы физико-математических и компьютерных наук, защитивший в этом году магистерскую диссертацию на тему «Неавторегресионная конволюционная модель для задачи генерации речи»: Неавторегрессионная конволюционная модель для задачи генерации речи – Выпускные квалификационные работы студентов НИУ ВШЭ – Национальный исследовательский университет «Высшая школа экономики» (hse.ru)
  15. Немного информации к размышлению на заданную тему можно найти здесь: https://habr.com/ru/post/455156/